在重組蛋白生產(chǎn)過(guò)程中，生物污染一直是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。生物污染的來(lái)源多種多樣，細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等生物污染會(huì)造成嚴(yán)重的藥品質(zhì)量事件，威脅用藥患者生命安全。因此，對(duì)已生產(chǎn)的藥品或正在生產(chǎn)的藥品，我們要盡量準(zhǔn)確的檢測(cè)其中的微生物與病毒的生物負(fù)荷，避免受到污染藥品流入市場(chǎng)。
漢騰生物擁有1200+㎡的GMP質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室，擁有國(guó)際一流的先進(jìn)設(shè)備，具備符合ChP, USP, EP等藥典要求的檢測(cè)能力，滿足全面的數(shù)據(jù)可靠性要求。
漢騰生物重組蛋白生產(chǎn)平臺(tái)擁有自主開(kāi)發(fā)的高表達(dá)CHO細(xì)胞株構(gòu)建平臺(tái)，為客戶提供專業(yè)的雙抗特異性抗體（BsAb）和重組蛋白生產(chǎn)服務(wù)。
漢騰生物車間生產(chǎn)工藝流程圖
整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，原材料（生物來(lái)源），細(xì)胞庫(kù)（主細(xì)胞庫(kù)，工作細(xì)胞庫(kù)），未加工原液物料（生物反應(yīng)器收獲前），下游工藝的適當(dāng)階段，原液等需要進(jìn)行微生物限度檢測(cè)，以確認(rèn)各工序中微生物負(fù)荷在規(guī)定范圍內(nèi)。
藥品生產(chǎn)過(guò)程中有關(guān)產(chǎn)品的微生物控制類型主要包括無(wú)菌檢測(cè)、微生物限度檢測(cè)和支原體檢測(cè)。
無(wú)菌檢測(cè)
無(wú)菌檢查法系用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無(wú)菌產(chǎn)品的最終放行需遵循各國(guó)法規(guī)，《中國(guó)藥典》2020版1101無(wú)菌檢測(cè)法，USP-NF <71> STERILITY TESTS，EP 2.6.1，JP 4.06均對(duì)產(chǎn)品無(wú)菌檢測(cè)進(jìn)行了規(guī)定，其中《中國(guó)藥典》2020版在無(wú)菌檢查方面的要求，完善了滅菌法和無(wú)菌檢查用隔離系統(tǒng)的驗(yàn)證及應(yīng)用。
無(wú)菌檢測(cè)的方法主要包括直接接種法和薄膜過(guò)濾法兩種：
微生物限度檢查
本法適用非無(wú)菌產(chǎn)品的微生物限度檢測(cè)，檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。潔凈空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如供試品有抗菌特性，應(yīng)盡可能去除或中和。
微生物限度的檢測(cè)，《中國(guó)藥典》2020版1105&1106&1107，USP-NF <61> &<1111>，EP 2.6.12&5.1.4等對(duì)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定，其中《中國(guó)藥典》2020版明確了半固體制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，半固體制劑與液體制劑一樣應(yīng)從嚴(yán)控制。
非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢測(cè)的方法主要包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和MPN法三種：
支原體檢測(cè)
2020版《中國(guó)藥典》3301 支原體檢查法中規(guī)定，在進(jìn)行主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批、對(duì)照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞需進(jìn)行支原體檢查時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采用培養(yǎng)法檢查支原體；必要時(shí)，亦可釆用指示細(xì)胞培養(yǎng)法篩選培養(yǎng)基。也可采用經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法。在進(jìn)行支原體檢驗(yàn)時(shí)，需要建立專門的支原體檢驗(yàn)室，以防止樣品的交叉污染。
采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行支原體檢查，其檢測(cè)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)法至少4周，指示細(xì)胞法至少2周，對(duì)于某些藥物，病人亟需使用來(lái)挽救生命時(shí)，傳統(tǒng)方法不再適用。2020版《中國(guó)藥典》9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，USP-NF ?1071? RAPID MICROBIAL TESTS FOR RELEASE OF STERILE SHORT-LIFE PRODUCTS: A RISK-BASED APPROACH（無(wú)菌短貨架期產(chǎn)品放行的快速微生物檢查法）以及EP 2.6.7（2007年首次提出用PCR技術(shù)進(jìn)行支原體檢測(cè)的指導(dǎo)綱要）均提出替代檢驗(yàn)方法的概念，即“在控制藥品微生物質(zhì)量中，微生物實(shí)驗(yàn)室出于各種原因，如成本、生產(chǎn)量、快速簡(jiǎn)便及提高藥品質(zhì)量等需要而采用非藥典規(guī)定的檢驗(yàn)方法（即替代方法）時(shí)，應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗(yàn)證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典的方法?！?br />
微生物污染溯源調(diào)查
無(wú)菌檢測(cè)、微生物檢測(cè)及支原體檢測(cè)都是培養(yǎng)的方法來(lái)確定樣品是否被微生物污染。培養(yǎng)法更多依賴于人員的熟練操作，操作人員經(jīng)驗(yàn)不足或操作不規(guī)范易形成假陽(yáng)性，樣品檢驗(yàn)方法的不適用，又易形成假陰性的結(jié)果。假陰性與假陽(yáng)性的結(jié)果嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為患者用藥安全帶來(lái)極大隱患。
對(duì)于假陰性結(jié)果，若不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，則會(huì)導(dǎo)致污染批次產(chǎn)品正常放行，危及病人安全，最終導(dǎo)致產(chǎn)品召回，品牌受損，甚至工廠停工或倒閉。為避免假陰性的結(jié)果，更多的是對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程規(guī)范性，人員上崗操作能力的要求。
對(duì)于假陽(yáng)性結(jié)果，如果沒(méi)有找到造成污染的根本原因，法規(guī)是禁止進(jìn)行重復(fù)測(cè)試的，這就需要大量的調(diào)查以找到根源，若無(wú)法調(diào)查出根本原因，最終可能導(dǎo)致該批次產(chǎn)品的報(bào)廢。這就要求我們對(duì)微生物陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行污染調(diào)查。
《中國(guó)藥典》2020版 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則中指出，“大多數(shù)非無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程和部分無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，對(duì)所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)（桿狀、球狀、細(xì)胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其他染色特性，及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、過(guò)氧化氫酶和凝固酶反應(yīng)）進(jìn)行分析，一般即可滿足需要”、“非無(wú)菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應(yīng)達(dá)到藥典規(guī)定的水平”、“無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性、無(wú)菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴(yán)重異常事件時(shí)，對(duì)檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種水平，必要時(shí)需達(dá)到菌株水平”。
傳統(tǒng)的表型鑒定技術(shù)包括觀察菌落的形態(tài)（如大小、顏色等）、染色、顯微鏡檢查以及生化鑒定等，微生物的表型具有一定的可變性，此外，傳統(tǒng)的表型鑒定技術(shù)依賴人員經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)條件，其在一些難以培養(yǎng)、生長(zhǎng)緩慢或需要特殊營(yíng)養(yǎng)的微生物鑒定方面的局限性大。
在應(yīng)對(duì)藥品微生物污染事件時(shí)，傳統(tǒng)方法已不能滿足快速分型、準(zhǔn)確鑒定、溯源分析的需要。因此，以分子生物學(xué)為代表的基因型鑒定方法逐漸得到應(yīng)用?！吨袊?guó)藥典》2020版，對(duì)無(wú)菌或微生物檢測(cè)陽(yáng)性異常結(jié)果的調(diào)查，新增了1021細(xì)菌DNA特征序列鑒定法。如細(xì)菌16SrDNA測(cè)序技術(shù)、真菌18SrDNA測(cè)序技術(shù)。
微生物的溯源分析中涉及的病原微生物操作及鑒定，應(yīng)該生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行（P2），漢騰生物已于2022年取得P2實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)，可承接相關(guān)病原微生物的分離、純化、保種及鑒定等工作。
2017年中國(guó)加入ICH，中國(guó)醫(yī)藥行業(yè)充分利用中國(guó)加入ICH全面與國(guó)際接軌的時(shí)機(jī)，進(jìn)一步借鑒國(guó)內(nèi)外成熟的、先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)、結(jié)合我國(guó)藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制現(xiàn)狀，加強(qiáng)通用性技術(shù)要求的制定以及國(guó)際協(xié)調(diào)和統(tǒng)一。
漢騰生物QC擁有先進(jìn)的自動(dòng)化檢驗(yàn)設(shè)備，配備了足夠的專業(yè)檢測(cè)人員，具有重組蛋白、抗體、疫苗等方面的檢測(cè)能力以及相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，建立了完善的生產(chǎn)前、生產(chǎn)中及生產(chǎn)后產(chǎn)品質(zhì)量控制策略。具備的檢測(cè)能力包括：
HPLC/UPLC類：SEC, CEX, 肽圖，PR-HPLC;
電泳類：CE-SDS, cIEF, SDS-PAGE, 核酸瓊脂糖電泳，IEF
免疫學(xué)類：ELISA活性，免疫印跡，免疫電泳，HCP（CHO，E.coli, 人源細(xì)胞），SelectVII 殘留
生物學(xué)活性類：細(xì)胞增殖抑制（MTT）,流式細(xì)胞法
微生物類：微生物限度，無(wú)菌，細(xì)菌內(nèi)毒素（凝膠法，動(dòng)態(tài)法）
其他常規(guī)理化類：不溶性微粒，TOC,滲透壓，密度，蛋白含量（UV, Brandford）,水分，化學(xué)滴定反應(yīng)，薄層色譜……
具備BLS-2實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)，符合生物安全的法規(guī)與要求。